使用手册（目录号：KINGBIO-1402）

1          试剂盒概述：

本试剂盒用于快速构建SgRNA体外转录载体，可以通过T7-RNA聚合酶体外转录获得SgRNA。本试剂盒还提供可用于体外转录Cas9酶mRNA的质粒，可用于后续通过显微注射SgRNA与Cas9酶mRNA制备“基因敲除”或“基因敲入”动物。

2          本试剂盒内容：

(1)线性化pHMG-T7-SgRNA质粒；(20ng/µl，20 µl)

(2)线性化pHMG-Cas9质粒；(0.5µg/µl，20 µl)

本试剂盒不提供，但可能需要：

(1)感受态大肠杆菌(如:DH5α)

(2)T₄ DNA连接酶及缓冲液

3          保存条件：

－20℃

4          CRISPR-Cas9靶点设计原则

4.1        目标基因序列的获取

目标基因的基因组序列的信息，可从NCBI、Ensembl或UCSC等数据库获取。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ensembl.org/index.html

https://www.genome.ucsc.edu/

4.2        CRISPR-Cas9靶点位置的选择

根据研究目的，在合适位置寻找并选择CRISPR-Cas9靶点。一般可在目标基因ATG 之后，编码序列的前2/3 区域，且不在最后一个外显子上；若需要，最好能破坏目标蛋白重要的结构域和/或所有的转录本。可以利用网上的CRISPR-Cas9工具网站设计CRISPR-Cas9靶点。

http://crispr.mit.edu/

http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx

4.3        CRISPR-Cas9 靶点识别序列的构成

CRISPR-Cas9 靶点识别序列通常含20个碱基，紧邻靶点3’端的3个碱基构成 PAM 区，并遵循NGG的原则，完整靶点序列为 (N)₂₀NGG。Cas9靶点可在cDNA的正义链也可在反义链上。

5          实验方法与流程：

5.1        CRISPR-Cas9 靶点识别序列的合成

根据将要进行打靶的位置设计并合成互补的Oligos*：

  正链：       5’-TAGGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

  反义链：              3’-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

*注：下划线部分为酶切位点的粘性末端，能够确保发生退火后的Oligos能够定向克隆到载体中。

5.2        Oligos的退火

将上述Oligos按照100µM的浓度各取20µl混合，放置入1.5mL的螺纹口EP管中。取500mL烧杯，加入300mL水，微波炉加热到沸腾。将含有Oligos的EP管，放入浮漂中，然后置于沸水中，自然冷却至室温。退火后的Oligos可以直接用于后续的连接反应，或放置于－20℃保存。

5.3        SgRNA的连接

连接反应按照下述比例进行：

实验组：

pHMG-T7-SgRNA      2µl

Oligos                         8 µl

T₄ DNA 连接酶         2µl

10×连接酶缓冲液     2 µl

H₂O                             6 µl

                                  20 µl

负对照组：

pHMG-T7-SgRNA     2µl

Oligos                         0 µl

T₄ DNA 连接酶         2 µl

10×连接酶缓冲液     2 µl

H₂O                           14 µl

                                  20 µl