使用手册（目录号：KINGBIO-1401）

1       试剂盒概述：

本试剂盒用于快速CRISPR-Cas9载体构建，实现在哺乳动物细胞中对目标基因进行定点“基因敲除”或“基因敲入”。

2       本试剂盒内容：

1）     pHMG-SgRNA线性化质粒 (20ng/µl，□10ul  □50 µl)

2 )    菌落PCR正向引物：SgRNA-Test-F （10uM, □100ul，□500ul）

 序列：5’-GAGCGAACGACCTACACCGA -3’

3）pHMG-SgRNA测序引物：SgRNA-Seq-F（10µM，□10ul  □50 µl)

   序列：5’-GACTATCATATGCTTACCGT-3’

本试剂盒不提供，但可能需要：

4）     感受态大肠杆菌(如:DH5α)

5）     T₄ DNA连接酶及缓冲液

3       保存条件：

－20℃

4       CRISPR-Cas9靶点设计原则：

4.1        目标基因序列的获取

目标基因的基因组序列的信息，可从NCBI、Ensembl或UCSC等数据库获取。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ensembl.org/index.html

https://www.genome.ucsc.edu/

4.2        CRISPR-Cas9靶点位置的选择

根据研究目的，在合适位置寻找并选择CRISPR-Cas9靶点。一般可在目标基因ATG 之后，编码序列的前2/3 区域，且不在最后一个外显子上；若需要，最好能破坏目标蛋白重要的结构域和/或所有的转录本。可以利用网上的CRISPR-Cas9工具网站设计CRISPR-Cas9靶点。

http://crispr.mit.edu/

http://zifit.partners.org/ZiFiT/CSquare9Nuclease.aspx

4.3        CRISPR-Cas9 靶点识别序列的构成

CRISPR-Cas9 靶点识别序列通常含20个碱基，紧邻靶点3’端的3个碱基构成 PAM 区，并遵循NGG的原则；此外，由于载体上的hU6启动子转录SgRNA时需要从鸟嘌呤G开始，因此在选择SgRNA时，第1位核苷酸最好为G；所以，实验中完整靶点序列为G(N)₁₉NGG。Cas9靶点可在cDNA的正义链也可在反义链上。

5       实验方法与流程：

5.1        CRISPR-Cas9 靶点识别序列的合成

根据将要进行打靶的位置设计并合成互补的Oligos*：

 正链：      5’-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

 反义链：             3’-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5’

*注：

(1)如果第1位核苷酸不是G，则需要在第1位核苷酸前再加一个G。参考文献：Nature Protocol, Vol.8, No.11, pp2281-2308;

(2)下划线部分为酶切位点的粘性末端，能够确保发生退火后的Oligos能够定向克隆到载体中。

5.2        Oligos的退火

将上述Oligos按照100µM的浓度各取20µl混合，放置入1.5mL的螺纹口EP管中。 取500mL烧杯，加入300mL水，微波炉加热到沸腾。将含有Oligos的EP管，放入浮漂中，然后置于沸水中，自然冷却至室温。退火后的Oligos可以直接用于后续的连接反应，或放置于－20℃保存。

5.3        SgRNA的连接

连接反应按照下述比例进行：

实验组：

pHMG-SgRNA           1µl

Oligos                         4 µl

T₄DNA 连接酶           1µl

10×连接酶缓冲液     1 µl

H₂O                              3 µl

                                   10 µl